使用工程核酸酶的基因组编辑技术，比如锌指核酸酶（ZFN）、转录激活因子样效应物核酸酶（TALEN）和CRISPR系统中的Cas蛋白已被用于操纵许多有机体的基因组。最近，科学家们已将胞苷脱氨酶或腺苷脱氨酶与CRISPR-Cas9融合在一起，构建出可编程的DNA碱基编辑器，从而为校正致病性突变提供新的机会。除了对DNA进行编辑之外，ADAR腺苷脱氨酶也被用于对RNA进行精确编辑：将腺苷（A）转换为肌苷（I），即A→I转换。三种类型的ADAR蛋白已在哺乳动物中鉴定出：ADAR1（异构体p110和p150）、ADAR2和ADAR3，它们的底物都是双链RNA（dsRNA）。在翻译期间，肌苷被认为在模拟鸟苷（G）。
为了实现靶向RNA编辑，ADAR蛋白或者它的催化结构域与一种λN肽、一种SNAP标签或一种Cas蛋白（dCas13b）融合在一起，而且向导RNA（gRNA）经设计后将这种融合的ADAR蛋白招募到特定位点上。此外，人们还报道，过量表达的ADAR1或ADAR2蛋白与带有R/G基序的gRNA一起也能够实现靶向RNA编辑。
在哺乳动物系统中，所有这些报道的核酸编辑方法都依赖于两种组分---一种酶和gRNA---的异位表达。尽管这些双组分核酸编辑系统在大多数研究中高效地发挥作用，但是一些遗传障碍限制了它们的广泛应用，特别是在治疗方面。这是因为体内最有效的基因治疗递送方法是通过病毒载体实现的，而且高度理想的腺相关病毒（AAV）载体递送的货物（指的是编码这两种组分的DNA）大小是有限的，大约为4500个碱基，这就使得利用病毒载体容纳这两种组分充满挑战。科学家们最近已报道，ADAR1的过度表达因对RNA进行异常的高度编辑而在多发性骨髓瘤中具有致癌性，并可产生大量的全局性的脱靶编辑。蛋白或它们的非人类来源的结构域的异位表达也存在着引发免疫原性的潜在风险。再者，预先存在的适应性免疫和p53介导的DNA损伤反应可能会破坏诸如Cas9之类的治疗性蛋白的功效。
RNA编辑的内在作用机制可通过将预组装的靶转录物---RNA双链体---注射到非洲爪蟾的胚胎中加以实现。2019年1月，Stafforst及其同事们报道了一种称为RESTORE的RNA编辑方法，它的作用机制是使用经过复杂化学修饰的化学合成反义寡核苷酸来招募内源性的ADAR。
如今，在一项新的研究中，中国北京大学魏文胜（Wensheng Wei）课题组描述了一种使用内源性ADAR进行RNA编辑的替代方法。他们证实表达招募ADAR的RNA（ADAR-recruiting RNA, arRNA），能够实现对内源性RNA进行高效而又精确的编辑，并且成功地校正致病性突变。相关研究结果于2019年7月15日在线发表在Nature Biotechnology期刊上，论文标题为“Programmable RNA editing by recruiting endogenous ADAR using engineered RNAs”。
魏文胜课题组将这种方法称为LEAPER（leveraging endogenous ADAR for programmable editing of RNA, 利用内源性ADAR对RNA进行可编程编辑）。具体而言，LEAPER利用经过改造的arRNA招募天然的ADAR1或ADAR2酶，从而将特定的腺苷转变为肌苷。
他们发现由质粒或病毒载体或者作为合成寡核苷酸递送的arRNA都可实现较高的编辑效率，最高可达80％。LEAPER是高度特异性的，具有极低的全局性脱靶编辑率，而且在靶区域中对除腺苷之外的碱基进行有限的编辑。
此外，魏文胜课题组发现LEAPER在包括多种人原代细胞在内的很多细胞类型中具有活性，并且能够在源自赫尔勒综合征（Hurler syndrome）患者的原代成纤维细胞中恢复α-L-艾杜糖醛酸酶（α-L-iduronidase）的催化活性，而不会引起先天性免疫反应。
由此可见，魏文胜课题组发现具有足够长度的线性arRNA的表达可引导内源性ADAR蛋白在靶转录物上进行碱基编辑：将腺苷转化为肌苷。相比于现有的编辑方法，LEAPER有几个优点。arRNA分子较小的尺寸让人想起RNA干扰（RNAi），在RNAi中，小的双链RNA分子诱导一种实现RNA靶向降解的天然机制，再者，这种较小的尺寸使得能够通过各种病毒载体和非病毒载体加以递送。不同于RNAi的是，LEAPER催化精确的A→I转换，而不会切割或降解靶转录物。虽然arRNA的长度要比RNAi长，但是arRNA既不诱导细胞水平上的免疫刺激作用，也不影响内源性ADAR蛋白的功能，这就使得它成为一种靶向RNA的安全策略。相反之下，人们已报道ADAR蛋白或它们的催化结构域的异位表达诱导了大量的全局性的脱靶编辑，并且可能诱发癌症。类似地，据报道，由于效应蛋白的表达，DNA碱基编辑器在小鼠胚胎、水稻或人细胞系中产生了大量的脱靶单核苷酸突变。LEAPER实现了高效编辑，而且同时很少发生全局性脱靶编辑。此外，它可能比需要引入外源蛋白的方法具有更低的免疫原性。
与Stafforst团队在2019年1月报道的一种称为RESTORE的RNA编辑方法相比，LEAPER中的arRNA可通过多种方式产生，包括化学合成和利用病毒载体或非病毒载体进行体内表达，然而，RESTORE中的gRNA仅限于依赖于复杂化学修饰的化学合成反义寡核苷酸。
LEAPER的效率和特异性仍有改进空间。与招募ADAR的支架RNA（scaffold RNA）融合在一起的arRNA可能增加局部的ADAR蛋白浓度，从而提高编辑收益率。让arRNA保持稳定或增加它表达的方法可能进一步提高RNA编辑效率。作为一种单分子系统，LEAPER实现精确而又高效的RNA编辑，有潜力广泛地适用于治疗和基础研究。
在几天之前，美国麻省理工学院麦戈文脑科学硏究所研究员、布罗德研究所核心成员张锋（Feng Zhang）及其团队如今开发出一种称为RESCUE（RNA Editing for Specific C to U Exchange, C→U交换特异性的RNA编辑）的策略：利用一种失活的Cas13将RESCUE引导到RNA转录本中的目标胞嘧啶碱基上，并使用一种新的、经过进化的、可编程的酶将不想要的胞嘧啶（C）转化为尿苷（U），从而指导RNA指令发生变化。RESCUE建立在REPAIR技术的基础之上，其中REPAIR也是由张锋团队开发的，可将碱基腺嘌呤转化为RNA中的肌苷（Science, 2017, doi:10.1126/science.aaq0180）。相关研究结果于2019年7月11日在线发表在Science期刊上，论文标题为“A cytosine deaminase for programmable single-base RNA editing”。
之前开发的REPAIR平台使用靶向RNA的 CRISPR/Cas13将一种称为ADAR2的RNA编辑器的活性结构域引导至特定的RNA转录物，在那里它能够将腺嘌呤（A）转换为肌苷（I），即A→I。由于不存在具有替代活性的天然编辑器，张锋和他的同事们进行了REPAIR融合，并在实验室中让它进行进化，直到它能够将胞嘧啶转换为尿苷，即C→U转换。
RESCUE能够被引导至任何选择的RNA，然后通过这种平台中经过进化的ADAR2组分执行C→U编辑。张锋团队将这种新平台导入到人细胞中，结果表明这能够靶向人细胞中的天然RNA以及合成RNA中的24种临床相关突变。然后，他们进一步优化了RESCUE以减少脱靶编辑，同时最小程度地降低对在靶编辑的干扰。
综上所述，魏文胜课题组开发的LEAPER工具和张锋团队开发的RESCUE工具能够填补核酸编辑工具箱中的关键空白，有助于推动科学家们实现更精确的RNA编辑，并且最终有助于治疗一系列由突变引起的疾病。
文章来源：生物谷
原文链接：https://www.nature.com/articles/s41587-019-0178-z
